Mikä on polymeraasiketjureaktio (pcr)? tosiseikkoja testistä, vaiheista ja mihin niitä käytetään

Mikä on PCR (polymeraasiketjureaktio)?

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on tekniikka, jota käytetään monistamaan DNA: n (ja joissain tapauksissa RNA: n) vähäisiä määriä, jotka sijaitsevat melkein missä tahansa nesteessä tai pinnalla, jolle DNA-juosteet voivat olla talletettuja. Avain PCR: n ymmärtämiseen on tietää, että jokainen ihminen, eläin, kasvi, loinen, bakteeri tai virus sisältää geenimateriaalia, kuten DNA (tai RNA) -sekvenssejä (nukleotidisekvenssejä tai DNA- tai RNA-kappaleita), jotka ovat omat lajilleen, ja kyseisen lajin yksittäiselle jäsenelle. Näin ollen, jos näyte sisältää DNA- tai RNA-segmenttejä, PCR on menetelmä, jota käytetään monistamaan (tekemään paljon identtisempiä kopioita) näistä ainutlaatuisista sekvensseistä, jotta niitä voidaan sitten käyttää erittäin suurella todennäköisyydellä määrittämään lähteen identiteetti (a tietty henkilö, eläin tai patogeeninen organismi), joka on jäljitettävissä DNA: sta tai RNA: sta, joka löytyy melkein mistä tahansa materiaalinäytteestä tai sen päällä.

PCR-monistus on kuitenkin vain osa tunnistustestiä. Kun monistus on tehty (katso alla), monistettuja segmenttejä on verrattava muihin tunnetusta lähteestä tuleviin nukleotidisegmentteihin (esimerkiksi tietty henkilö, eläin tai patogeeninen organismi). Tämä ainutlaatuisten segmenttien vertailu tehdään usein sijoittamalla PCR: n tuottamat nukleotidisekvenssit tunnettujen nukleotidisekvenssien viereen ihmisistä, patogeeneistä tai muista lähteistä erottavaan geeliin. Sähkövirta johdetaan geelin läpi ja eri nukleotidisekvenssit muodostavat nauhat, jotka muistuttavat "tikkaita" niiden sähköisen varauksen ja molekyylikoko mukaan. Tätä kutsutaan geelielektroforeesiksi. Nauhat tai "tikkaat", kuten vaiheet, jotka siirtyvät samoille tasoille geelissä, osoittavat nukleotidisekvenssien identiteetin. Tämä menetelmä on yksi suosituimmista tavoista, joilla PCR-testit suoritetaan (katso kuva 1).

Kuvio 1, nauhat tai "tikkaat" kuten PCR: llä tuotetun Mycobacterium-DNA: n vaiheet (CDC: n suosiossa)

Kuva. Toistuvat elementit (Rep) –PCR (A) ja pulssikenttägeelielektroforeesi (PFGE) (B) -mallit Mycobacterium cosmeticum -isolaateista kahdelta Ohion potilaalta ja yhdeltä potilaalta Venezuelasta. Rep-PCR suoritettiin käyttämällä BOXA1R-aluketta (3), ja PFGE suoritettiin restriktioentsyymillä AseI. Kaistat 1, 2, Ohio eristää OH1 ja OH2; kaistat 3, 4, kontrollikannot ATCC BAA-878T ja ATCC BAA-879; kaista 5, Venezuelan isolaatti VZ1. DNA-koon standardit ovat 100 bp (S1) ja 48, 5 kb: n merkki (S2).

Kuinka PCR (polymeraasiketjureaktio) tehdään?

Vuonna 1983 Kary Mullis keksi perusvaiheet DNA-sekvenssien monistamiseksi. Hänelle ja Michael Smithille myönnettiin Nobel-palkinto tämän menettelyn kehittämisestä vuonna 1993. On olemassa muutamia perusvaiheita, joita seurataan peräkkäin; PCR voidaan tehdä yhdessä putkessa sopivien kemikaalien ja erityisesti suunnitellun lämmittimen avulla. Tarvittavat reagenssit tai kemikaalit ovat seuraavat:

• Näyte, joka sisältää nukleotidisekvenssin (verestä, hiuksista, mätästä, ihon raapimisesta jne.)
• DNA-alukkeet: lyhyt yksijuosteinen DNA, joka kiinnittyy nukleotidisekvensseihin, mikä edistää nukleotidien komplementaarisen juosteen synteesiä
• DNA-polymeraasi: entsyymi, joka, kun DNA: hon on sitoutunut aluke, menee alas DNA-segmenttiin, joka kiinnittää DNA: n rakennuspalikoita muodostamaan komplementaarisia emäspareja ja syntetisoi siten DNA: n komplementaarisen nukleotidiketjun (lämpöä kestävän DNA-polymeraasin Taq käyttöönotto) lämpökestävistä bakteereista johdettu polymeraasi paransi merkittävästi kykyä suorittaa PCR)
• Liuoksessa on suuri ylimäärä DNA-rakennuslohkoja, joita kutsutaan nukleotideiksi (adeniini, tymidiini, sytosiini ja guaniini, lyhennettynä vastaavasti: A, T, C ja G). Kun nämä lohkot on kytketty toisiinsa, ne muodostavat nukleotidisekvenssin tai yhden DNA-juosteen. Kun nämä rakennuspalikat sitoutuvat komplementaariseen rakennuspalikkaansa heikoilla vety sidoksilla (esimerkiksi A sitoutuu vain T: n kanssa ja G vain C: n kanssa), muodostuu komplementaarinen DNA-nukleotidisekvenssi, joka sitoutuu alkuperäiseen yksijuosteiseen DNA: han. Kun sitoutuminen on valmis, muodostuu komplementaarinen kaksijuosteinen DNA spesifisessä sekvenssissä.

Sitten PCR alkaa DNA-segmentillä näytteestä, joka asetetaan putkeen yllä lueteltujen reagenssien kanssa. Liuos kuumennetaan vähintään 94 ° C: seen (201, 2 F); tämä lämpö hajottaa vety sidokset, jotka sallivat komplementaaristen DNA-juosteiden muodostumisen, joten seoksessa on vain yksittäisiä juosteita (tätä kutsutaan kaksijuosteisen DNA: n denaturoitumiseksi).

Seoksen annetaan jäähtyä noin 54 ° C: seen (129, 2 F). Tässä lämpötilassa DNA-alukkeet ja DNA-polymeraasi sitoutuvat yksittäiseen yksijuosteiseen DNA: han (tätä kutsutaan DNA: n hehkuttamiseksi). Koska rakennuspalikoita on liikaa (korkea konsentraatio) seoksessa, polymeraasi käyttää niitä tuottamaan uusia komplementaarisia DNA-juosteita (nimitetään DNA: n jatkeeksi) ja tämä prosessi on nopeampi lämpötilassa 72 ° C (161, 6 F). Tämä prosessi luo uuden kaksijuosteisen DNA-molekyylin alkuperäisen molekyylin kustakin yksittäisestä juosteesta.

Tämä sykli toistetaan noin 40 kertaa koneessa, jota kutsutaan lämpölämmittimeksi, joka toistaa automaattisesti lämmitys-jäähdytysjaksot, jolloin kunkin DNA-sekvenssin määrä kaksinkertaistuu joka kerta kun lämmitys-jäähdytysjakso on valmis. Se, mikä alun perin oli yksi lyhyt DNA-segmentti, voidaan monistaa noin 100 miljardiin kopioon 40 kaksinkertaistamisjakson jälkeen.

Miksi lääkäri tilata PCR-testin (polymeraasiketjureaktio)?

PCR-testi muodostaa perustan useille testeille, joilla voidaan vastata moniin erilaisiin lääketieteellisiin kysymyksiin, jotka auttavat lääkäreitä diagnosoimaan ja hoitamaan potilaita. Esimerkiksi PCR-testit voivat havaita ja tunnistaa patogeeniset organismit potilailla, etenkin ne, joita on vaikea kasvattaa (esimerkiksi HIV ja muut virukset ja tietyt sienet).

Muut lääkärit tilaavat PCR-testejä geneettisten sairauksien diagnosoimiseksi, kun taas toiset lääkärit käyttävät PCR-tutkimuksia biologisten suhteiden havaitsemiseksi, kuten lasten vanhempien tunnistamiseen. PCR-testejä käytetään myös tunnistamaan ja karakterisoimaan tietyissä syövissä havaitut geneettiset mutaatiot ja uudelleenjärjestelyt.

PCR-testejä on kuitenkin muutettu ja laajennettu moniin tieteellisten tutkimusten näkökohtiin, mukaan lukien evoluutiobiologia, geneettinen sormenjälki, oikeuslääketutkimukset ja monet muut.

Mikä on RT-PCR?

RT-PCR on PCR-testi, joka on suunniteltu RNA: n havaitsemiseksi ja mittaamiseksi. Vaikka alkuperäisissä PCR-kokeissa monistettiin DNA: ta, monet virukset ja muut biologiset komponentit (esimerkiksi mitokondriat) käyttävät RNA: ta geneettisenä materiaalinaan. RT-PCR eroaa tavanomaisesta PCR: stä ottamalla ensin RNA ja muuttamalla RNA-juoste DNA-juosteeksi. Tämä tehdään oleellisesti samalla menetelmällä PCR: n suhteen, joka on kuvattu yllä, paitsi käyttämällä entsyymiä, jota kutsutaan käänteistranskriptaasiksi DNA-polymeraasin sijasta. Käänteinen transkriptaasi sallii yhden RNA-juosteen translaation komplementaariseksi DNA-juosteeksi. Kun tämä reaktio tapahtuu, rutiininomaista PCR-menetelmää voidaan sitten käyttää DNA: n monistamiseen. RT-PCR: ää on käytetty monien RNA-virusten havaitsemiseksi ja tutkimiseksi.

RT-PCR: ää ei pidä sekoittaa toiseen PCR-variaatioon, jota kutsutaan reaaliaikaiseksi PCR: ksi. Reaaliaikainen PCR on PCR-variaatio, joka mahdollistaa monistetun DNA: n analysoinnin toimenpiteen tavanomaisen 40 jakson aikana. Vaikka menettelytapa on samanlainen kuin tavanomainen PCR, jossa käytetään syklisiä reaktioita, reaaliaikaisessa PCR: ssä käytetään fluoresoivia väriaineita, jotka on kiinnitetty joihinkin rakennuspalikoihin tai pieniin nukleotidiketjuihin. Käytetystä menetelmästä riippuen fluoresenssi tapahtuu, kun monistetut DNA-juosteet muodostuvat. Fluoresenssin määrä voidaan mitata 40 syklin ajan, ja se antaa tutkijoille mahdollisuuden mitata spesifisiä tuotteita ja niiden määrää monistusjakson aikana. Tämä antaa tutkijoille tai laboratorioteknikkoille usein mahdollisuuden ohittaa geelielektroforeesi tai muut toissijaiset toimenpiteet, joita tarvitaan PCR-tuotteiden analysointiin, tuottaen siten nopeampia tuloksia.

Reaaliaikainen PCR ja RT-PCR ovat alkuperäisen PCR-testin muunnelmia tai muunnoksia. On kuitenkin olemassa paljon enemmän muunnelmia (ainakin 25), joita käytetään tiettyjen ongelmien ratkaisemiseksi. Niillä kaikilla on eri nimet, kuten Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR ja monet muut.

PCR: ää muutetaan todennäköisesti jatkamaan vastausta kaikkiin muihin lääketieteen, biologian kysymyksiin. ja muut opiskelualat.